大きな脳はエネルギーを大量に消費するため、脊椎動物全般においてエネルギーの利用を促進する代謝特性と関連している。しかし、これらの特性を駆動する生物学的根拠は不明である。疾患研究において宿主の代謝を調節する役割を考慮し、我々は腸内微生物叢が脳のエネルギー要件に関連する代謝を含め、脊椎動物の種間での正常な代謝の違いに寄与しているという仮説を立てた。無菌マウスに3種の霊長類（2種は比較的大きな脳を持ち、1種はより小さな脳を持つ）の腸内微生物叢（GM）を接種することで、脳が大きい霊長類のGMは宿主の代謝をエネルギーの利用と生成にシフトさせ、脳が小さい霊長類のGMは脂肪組織へのエネルギー貯蔵を刺激することを実証した。私たちの研究結果は、相対的な脳の大きさに関連する代謝における通常の宿主種間差異における GM の因果的役割を確立し、GM が人類の進化の過程で脳化を支えた代謝変化の重要な促進因子であった可能性があることを示唆しています。
キーワード
著者ノート
ACN、アセトニトリル。ALP、アルカリホスファターゼ。ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ。ASV、アンプリコン配列変異体。BMI、ボディマス指数。EQ、脳化商。GLMM、一般化線形混合効果モデル。GM、腸内細菌叢。RARE、リラクゼーション強化による急速な獲得。SCFA、短鎖脂肪酸。
腸内細菌叢（GM）が特定の宿主種内で代謝を形成する役割を研究する研究は多数あるが、腸内微生物が宿主種間での代謝の正常な違いに与える影響について調査した研究は限られている。我々は無菌マウスモデルを用いて、異なる霊長類種のGMが宿主代謝の違いを引き起こすことを示しました。さらに、比較的脳が大きい霊長類種のGMは宿主代謝をエネルギー生産と利用にシフトさせ、脳が小さい霊長類種のGMは宿主代謝をエネルギー貯蔵にシフトさせます。エネルギー生産と利用への代謝のシフトは、人間などの霊長類の大きな脳の進化の根底にあると考えられています。結果として、これらのデータは、ヒトの進化におけるGMの役割に関する予備的な証拠を提供します。
ドナーストックおよびマウス糞便サンプルからの生の 16S rRNA 遺伝子配列、マウス糞便サンプルからの生のショットガン配列、およびマウス肝臓 RNA 配列は、Sequence Read Archive (PRJNA1003977) で入手できます。分析に使用されたすべてのコードは、https://github.com/Kramato-lab/GF_mouse_primate_23およびhttps://github.com/Mallott-Lab/PrimateMicrobiomeandBrainGrowthで確認できます。
脳は、成長と維持に代謝コストがかかる組織です [ 1–3 ]。脳は、ニューロンシグナル伝達、シナプス形成、情報処理などの機能をサポートするために、体内のほぼすべての他の臓器よりも高いグルコース代謝率を持っています [ 4 ]。脳組織の高コストの維持の課題は、体の大きさに比べて脳が大きい傾向がある霊長類で特に顕著です [ 5 ]。したがって、脳化指数（EQ）（つまり、体の大きさに対する脳の大きさ）が高い霊長類は、一般的に空腹時血糖値が高いです [ 6 ]。すべての霊長類の中で相対的に最大の脳サイズを持つヒトは、体の大きさに基づいて予想されるよりも高い1日の総エネルギー消費量を示しています [ 7 ]。霊長類の代謝におけるこれらの違いを形成するメカニズムと、それが脳化の違いにどの程度関連しているかを知ることは、霊長類の脳の発達と生活史、および大型脳の進化を理解するために重要です。しかしながら、霊長類の種間で代謝生理学を比較する体系的なデータは稀であり、代謝が形成されるメカニズムを説明するデータはさらに稀である。いくつかの比較研究では、相対的に脳が大きい霊長類と小さい霊長類の間で遺伝的およびエピジェネティックな違いが検出されているが、特定された経路は全身代謝の違いに明確に関連していない[ 8 ]。
腸内細菌叢（GM）の多様性は、霊長類の代謝が脳のさまざまなエネルギー要件を促進する可能性がある未解明のメカニズムを表しています。代謝性疾患におけるGMの関与を示唆する研究では、特定の微生物機能と宿主の代謝特性の間に強い関連があることが実証されています[ 9、10 ]。特に、繊維とアミノ酸の発酵からGMによって生成される短鎖脂肪酸（SCFA）、酢酸、酪酸、プロピオン酸は、宿主のエネルギー源として機能し、直接的に、およびSCFA受容体を介したシグナル伝達を介して宿主の代謝プロセスにも影響を及ぼします[ 11 ]。これらのプロセスには、食欲と満腹感、脂肪生成、コレステロールとトリグリセリドの合成、およびグルコース-インスリン代謝が含まれます[ 9、12、13 ]。 SCFA のほとんどは糖尿病や肥満などの疾患における役割について研究されていますが、SCFA とこれらの宿主代謝プロセスとの相互作用によって、全身代謝がブドウ糖産生の増加へとシフトし、大きな脳の高エネルギー需要をサポートしたり、成長、維持、脂肪沈着などの身体機能が増加したりする可能性もあります。SCFA は、他の微生物代謝物と同様に、腸と脳の間のコミュニケーションを促進することで脳生理に影響を及ぼす可能性があり [ 14 ]、脳の進化とそれに関連する生活史のトレードオフをより広く理解するための重要なターゲットとなっています。霊長類の種にわたって体系的に収集された比較 SCFA データは限られていますが [ 15 ]、GM の組成と機能は霊長類の種間で著しく異なることが示されている [ 16, 17 ]。これらの違いが、代謝や生活史を含む霊長類の生理の種間変異にどの程度寄与しているかは、現在のところ不明です。私たちは、それらが他の身体システムを維持しながら、大きな脳を成長させ維持するために必要な代謝戦略を媒介する上で重要な役割を果たしているのではないかと仮説を立てています。
本研究では、マウスモデルを用いて、3種の霊長類におけるGM機能の違いが、脳のエネルギー要件の種差と一致する形で宿主の代謝表現型の違いに関連しているという初の証拠を提示した。無菌マウスに、マカクザル（Macaca mulatta）、リスザル（Saimiri boliviensis）、ヒト（Homo sapiens）の3種の霊長類のGMを接種した。ヒトとリスザルは系統発生的には遠い関係にあるが（一方はアメリカ大陸の広鼻猿で、もう一方はアフリカの類人猿）、どちらも出生後の脳の成長が速く、成人期には比較的脳が発達している（つまり、体の大きさに対して脳が大きい）ため、ライフサイクルを通じて脳を支えるためにより多くのエネルギーを必要とするため、「脳優先」種と見なすことができる[ 18, 19 ]。対照的に、マカク（アフリカの狭鼻猿）は出生後の脳の成長速度が遅く、成体になっても脳の発達が遅いため[ 18, 19 ]、脳を支えるのに必要なエネルギーが少なくなります。そこで、脳を優先する霊長類のGMが、宿主の代謝表現型の違いを促進し、脳に利用できるエネルギーの増加を促進するという仮説を検証しました。
私たちの結果は、私たちの全体的な仮説を裏付けるものである。比較的EQの高い2つの遠縁の霊長類種のGMを投与されたマウスは、食物消費量の増加と肝臓での糖新生による宿主のエネルギー利用と生産の増加と一致する代謝表現型を示した。対照的に、脳化が進んでいない（EQが低い）霊長類種のGMを投与されたマウスは、より速い体重増加と脂肪組織の沈着の増加を示し、ブドウ糖の利用と脂肪組織の沈着の間に潜在的なトレードオフがあることを裏付けている[ 20 ]。これらの違いは、微生物代謝物濃度、特にSCFAの差に関連していた。
霊長類のGMは、相対的脳化と一致するパターンで正常な宿主代謝表現型に因果的に影響を及ぼす。
離乳したC57BL/6無菌マウスに、成体のマカクザル（M. mulatta、低EQ）、リスザル（S. boliviensis、高EQ）およびヒト（H. sapiens、高EQ）のGMを合計3回接種した。ドナーの糞便サンプルの収集方法は、方法に記載されているように、ヒトと非ヒト霊長類ではわずかに異なっていた。マウスは60日間、標準的な固形飼料を自由に摂取させて飼育され、マウスの生理機能とGM機能に関するデータは複数の時点で収集された（図S1、本論文のオンライン補足資料で入手可能）。すべての霊長類GMがマウスに正常に移行された。3日後および60日後のマウス糞便サンプルのGM組成はドナーストックのものと類似しており、両時点で治療群間のGM組成に明らかな違いがあった（図S2、S3）。最初の時点でのドナー株とマウスの糞便サンプルは、それぞれヒト、マカクザル、リスザルの 18.4、5.9、6.2% のアンプリコン配列変異体 (ASV) を共有していました。ヒトのドナー株に存在する微生物属の 63% は、最初の時点でのマウスの糞便サンプルにも存在していました (表 S1)。最初の時点でのマウスの糞便サンプルには、マカクザル属の 37% (表 S2) とリスザル属の 30% (表 S3) が存在していました。
60日目の評価では、高EQ霊長類GMを接種したマウスと低EQ霊長類GMを接種したマウスの間で、さまざまな代謝特性に違いがあることを検出しました（図1）。宿主の脳の大きさには、処理間で差はありませんでした（F 2,23 = 0.2、P = 0.8、図1a）。これは、脳の大きさが動物種を超えて遺伝的に高度に伝達されていることを考えると予想されたことです[ 21 ]。より可塑性が期待される他の臓器では、高EQ霊長類を接種したマウスで、肝臓の大きさ（F 2,23 = 1.0、P = 0.4）と膵臓の大きさ（F 2,23 = 2.8、P = 0.08）が有意ではない傾向で増加することが観察されました（図1a）。対照的に、高 EQ 霊長類を接種したマウスは、体脂肪率が有意に低く（除脂肪体重と比較して; F 2.23 = 3.9、P = 0.03、図 1a、b）、その結果、平均してより多くの食物を消費したにもかかわらず（F 2,8 = 370.6、P < 0.001、図 1a ）、体重増加も少なかった（ F 2,23 = 5.4、P = 0.01 、図1a ）。各治療群のマウスのサブセットから採取した盲腸組織サンプルの病理学的検査では、異常は認められなかった（図 S4）。
図1.高 EQ 霊長類と低 EQ 霊長類のマイクロバイオームを接種したマウスを区別する生理学的変数。体重増加、脂肪率、平均食物摂取量 (ケージごとに測定) は、高 EQ 霊長類接種マウスと低 EQ 霊長類接種マウスで異なります ( a )。MRI で測定した肥満度は、高 EQ 霊長類接種マウスと低 EQ 霊長類接種マウスで異なります ( b )。血液化学は、高 EQ 霊長類接種マウスと低 EQ 霊長類接種マウスで異なります ( c )。
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高EQ霊長類を接種したマウスでは、エネルギー産生も高まったようでした。空腹時血糖値も上昇し（F 2,23 = 7.5、P = 0.003、図1c）、このパターンは特にヒトGMを接種したマウスで顕著でした。肝臓グリコーゲン含有量には、治療間で差はありませんでした（F 2,23 = 2.2、P > 0.1、図1b）。しかし、低 EQ 霊長類接種マウスと比較すると、高 EQ 霊長類接種マウスは、血中 ALP ( F 2,23 = 6.1、P = 0.008、図 1c ) および ALT ( F 2,23 = 7.8、P = 0.003、図 1c ) 濃度の上昇を示しました。後者は、他の炭水化物、脂質、タンパク質からのグルコースの生成である糖新生に関与する重要な酵素です。高 EQ 霊長類接種マウスでは、トリグリセリドの増加 ( F 2,23 = 12.4、P = 0.0002、図 1c ) とコレステロールの減少 ( F 2,23 = 4.6、P = 0.02、図 1c ) も示しました。これらの違いを合わせると、高 EQ 霊長類を接種したマウスは、より多くのブドウ糖を生成するが蓄積しないように代謝がプログラムされているのに対し、低 EQ 霊長類を接種したマウスは、ブドウ糖を脂肪として蓄積するだけでなく、全体的にブドウ糖を生成する量が少なくなるように代謝がプログラムされていることがわかります。
高EQと低EQの霊長類を接種したマウスでは、GMの組成と機能的潜在能力が異なる
全体的な GM 構成と機能的潜在性は治療群間で異なっていました (図 S5 および S6)。しかし、治療間で変化したのは GM 分類群のほんの一握りでした (図 S7 ～ S9)。一方、フコースおよびラムノースの分解、アミノ酸 (シトルリン、イノシン、スレオニン) の生合成、ピルビン酸の生合成、ピルビン酸から酢酸および乳酸への発酵、グリコーゲン分解、ガラクトース分解、およびデンプン分解に関連する GM 経路は、EQ の低い霊長類を接種したマウスよりも、EQ の高い霊長類を接種したマウスでより豊富でした (図 2a )。対照的に、ピルビン酸からブタン酸への発酵、グルタミン酸からプロパノ酸への発酵、およびグリコーゲン合成に関連する経路は、EQ の低い霊長類を接種したマウスでより豊富でした (図 2a )。さらに、高EQ霊長類を接種したマウスでは、糞便中の酢酸（F2,21 = 36.9、P < 0.001）、プロピオン酸（F2,21 = 30.4、P < 0.001）、酪酸（F2,21 = 12.0、P = 0.0003）、吉草酸（F1,21 = 20.4、P < 0.001）の濃度が増加した（図2b）。
図2.高 EQ および低 EQ 霊長類腸内細菌叢を接種したマウスの GM 間の機能的差異。複数の微生物経路の相対的存在量 ( a ) は、ヒトおよびマカクザル腸内細菌叢を接種したマウス間、およびリスザルおよびマカクザル腸内細菌叢を接種したマウス間で有意に異なりましたが、ヒトおよびリスザル腸内細菌叢を接種したマウス間では差がありませんでした。SCFA の糞便代謝物 ( b ) は、マカクザル腸内細菌叢を接種したマウスの濃度と比較して、ヒトおよびリスザル腸内細菌叢を接種したマウスのサンプルでより高濃度でした。
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糞便中の SCFA 濃度は、宿主に吸収されない SCFA を定量化します。しかし、宿主による異なる SCFA の吸収率に一貫した違いは知られていないため、糞便中の SCFA 濃度は、一般的に腸管での SCFA の生成と吸収に比例すると考えられています [ 22 ]。微生物による酢酸とプロピオン酸の生成の違いは、宿主の代謝に重要な影響を及ぼす可能性があります。どちらも腸管で吸収され、肝臓などの臓器に高濃度で到達することがよくあります [ 23–25 ]。主にマウスの研究に基づくと、酢酸は肝臓でのコレステロールとトリグリセリドの合成の基質であり、酢酸濃度の上昇は白色脂肪組織での脂肪生成を刺激することが知られています [ 26 ]。しかし、プロピオン酸濃度の上昇は酢酸のこの効果を阻害し、酢酸とプロピオン酸の両方の高濃度は、肝臓だけでなく他の組織でも糖新生を引き起こします [ 27, 28 ]。これらの効果は、SCFA がノルエピネフリン、グルカゴン、インスリン、グレリン、神経伝達物質、脂肪酸結合タンパク質に及ぼす影響を介して媒介されます [ 29, 30 ]。したがって、脳を優先する霊長類の GM による酢酸とプロピオン酸の微生物産生の増加は、直接的に脂肪生成の減少と糖新生の増加につながる可能性があります。この経路で生成されるグルコースは、特に基質要求がピークとなる出生後の成長と発達の時期に、脳にとって貴重なエネルギー源となる可能性があります [ 1 ]。さらに、酪酸は結腸細胞によってエネルギー源として優先的に使用されます [ 31 ]。腸は脳に次いでエネルギーを最も消費する組織であることを考えると [ 3, 32 ]、腸による酪酸の使用は、脳のための宿主エネルギーの他の源を解放する可能性があります。最後に、SCFAは血液脳関門を通過することができ[ 33 ]、そこでエネルギー源として、または代謝シグナル分子として直接利用することができる。
高EQおよび低EQ霊長類接種マウスの肝臓遺伝子発現は異なる
マウスの生理機能とGM機能の両方のパターンから、GMと宿主の代謝の関係を媒介する上で肝臓が重要な役割を果たしていることが示唆されたため、60日間の実験期間終了時にTagSeqを使用してマウスの肝臓における差次的遺伝子発現を評価した。肝臓遺伝子発現におけるドナー種特異的な差異（図S10）に加えて、高EQおよび低EQ霊長類接種マウスは異なる肝臓遺伝子発現パターンを示すことがわかった（図S11）。これらの遺伝子の一部は、糖新生、脂肪生成、コレステロール合成、脂肪酸代謝および脂肪細胞発達のさまざまな側面（例：Fabp5、Fasn、Elovl6、およびMup12）と関連付けられている[ 34–37 ]。しかし、肝臓代謝プロセスの制御は、遺伝子発現の変動によってのみ決定されるわけではなく、エネルギーおよび代謝物のフラックスのパターンとも密接に関連している[ 38, 39 ]。糖新生の基質として乳酸とアラニンが利用できることなど、他の重要な調節メカニズムも関係していると思われます。これらの基質は両方とも、ピルビン酸分解を介してピルビン酸-乳酸から生成され、アラニンはピルビン酸と吉草酸などの分岐鎖脂肪酸との相互作用を介して生成されます。私たちの GM データは、高 EQ 霊長類を接種したマウスでピルビン酸分解の増加、ピルビン酸生合成の増加、吉草酸濃度の増加の証拠を示しています。
さらに、MiMeNet解析により、87の微生物ASVを使用して、高EQ霊長類を接種したマウスの肝臓で差次的に発現する191の宿主遺伝子を予測できることが示されました（図S12）。これらのASVによって予測された遺伝子は6つの異なるモジュールにクラスター化され、2つの最大のモジュールには、それぞれ脂肪酸代謝とアミノ酸代謝に関連する遺伝子が含まれていました（図S13）。TagSeqデータの機能解析では、高EQ霊長類を接種したマウスは、肝臓でのアミノ酸、脂質、脂肪酸代謝が豊富であるとともに、これらの経路の多くで重要な補因子であるビオチンの代謝と輸送が変化していることも示されました（図3）。このパターンは、高EQ霊長類GMが糖新生や脂質シグナル伝達に密接に関連する他の経路を介して、エネルギー生産のために宿主の代謝をプログラムすることを示唆するさらなる証拠を提供します。高EQ霊長類を接種したマウスは、臓器損傷の兆候が見られなかったにもかかわらず、血小板シグナル伝達と、ある程度のフィブリン血栓形成も強化されていました（図3）。血小板は、創傷治癒などの免疫学的役割に加えて、新しいニューロンの形成などのプロセスを調整することにより、脳を含む中枢神経系の恒常性と可塑性に影響を与える重要なカルシウム依存性シグナル伝達分子として認識されています[ 40, 41 ]。したがって、この一連の代謝プロセスは、代謝性疾患の文脈以外でも、宿主の代謝を脳をサポートするためのエネルギー産生へとシフトさせる重要な役割を果たしている可能性があります。
図3.マウスの肝臓で処理によって異なる発現を示す機能経路。各種の比較でアップレギュレーションされた遺伝子が特定されました。Reactome 経路データベースを使用して、異なる発現を示す遺伝子の各セットで経路エンリッチメントを実行しました。値と陰影は、負の対数調整P値を表し、より有意なエンリッチメントは濃い青で表示されます。SQM = リスザル。
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高 EQ と低 EQ の霊長類を接種したマウス間の全体的な違いに加えて、ヒト GM を接種したマウスは他のすべてのマウスと比較して代謝生理機能と肝臓遺伝子発現が異なり、これはヒトがすべての霊長類の中で最も高い EQ を示すという事実と一致しています。たとえば、ヒトを接種したマウスは他のすべてのマウスと比較して、空腹時血糖値が高く ( F 2,23 = 7.5、P = 0.003、図 1c )、120 分間のブドウ糖負荷試験に対する空腹時血糖値のベースラインへの回復が遅いことがわかりました ( F 2,23 = 7.53、P = 0.003、図 1 )。同様に、ヒト接種マウスはトリグリセリドが最も高く（F 2,23 = 12.4、P = 0.0002、図1c）、コレステロールが最も低かった（F 2,23 = 4.6、P = 0.02、図1c）。また、研究期間中の体重増加も最も少なかった（F 2,23 = 5.4、P = 0.01）。微生物機能の点では、ヒト接種マウスはプロピオン酸（F 2,21 = 30.4、P < 0.001）と酪酸（F 2,21 = 12.0、P = 0.0003）の割合が最も高かった。これらのパターンを総合すると、ヒトGMは他の霊長類で観察されるものよりもさらに宿主代謝を脂肪生成から糖新生へと偏らせる可能性があることが示唆される。したがって、私たちのデータは、大きな脳の発達と維持を促進する人間の代謝適応の形成において、GM が潜在的な役割を果たしていることを示しています。
全体として、我々の研究結果は、霊長類におけるエネルギーの使用と生産と貯蔵の代謝表現型を媒介するGMの役割と一致している。我々のデータは、哺乳類の種内および種間の両方で、脳と体の成長の間に想定されるトレードオフを支持している[ 32, 42 ]。ヒトでは、脳のエネルギー需要の発達的変化は、乳児期から思春期の間の成長率の変化と反比例して変化し、ライフサイクルで最も遅い成長ペースと脂肪蓄積は、中年期の生涯の脳エネルギー使用量のピークと一致している[ 1, 43 ]。同様に、大型脳の進化は、他の組織でのエネルギー消費の減少を必要とするとしばしば仮定されてきた[ 3, 32, 44 ]。この進化的トレードオフを裏付けるように、哺乳類の種間での体の大きさに対する脳の大きさの変動は、脂肪組織の蓄積と反比例している[ 20 ]。脳が大きい霊長類は空腹時血糖値が高いだけでなく [ 6 ]、脂肪蓄積も低い [ 20 ]。高EQ霊長類のGMを接種したマウスでは成長と脂肪蓄積の両方が減少するという発見は、GMが脳と身体の間のエネルギー配分の分割に寄与していることと一致しており、広い分類範囲にわたって脳のエネルギーと脂肪蓄積および成長率の間にトレードオフがあるという新たな証拠と概ね一致している [ 1、20、45–47 ]。
重要なのは、人間の代謝は幼少時と成人時の両方で他の霊長類とは異なることが知られており [ 7, 48, 49 ]、この表現型は他の霊長類よりも比較的大きい脳を支えるための適応であるという仮説が立てられていることです。例えば、成人ではブドウ糖と脂肪の両方が増加しています [ 50 ]。ブドウ糖産生の増加はリアルタイムで脳に電力を供給するのに役立ちますが、脂肪の増加は、食料の入手可能性が低下したり、エネルギー需要が増加したりする状況で、脳の重要なバックアップエネルギー源として機能します [ 48 ]。この表現型は、成人のエネルギー予算が他の霊長類と比較して全体的に増加していることに関連している可能性があり [ 7 ]、これにより代謝のトレードオフが緩和され、他の霊長類と比較して、大きな脳のためのブドウ糖産生の増加や、脂肪の形でのブドウ糖の貯蔵の強化など、すべての機能に多くのエネルギーを割り当てることができます。我々のマウスはヒトに典型的な肥満の増加を示さなかったが、これはヒトと比較してマウスのエネルギー予算が制限されていることの結果であると我々は考えている。本研究のマウスはすべて同じ遺伝的背景から来ているため、ヒト以外の同様のエネルギー予算を持っていた可能性があり、ヒト遺伝子組み換えを接種したマウスでさえ霊長類に典型的なエネルギーのトレードオフを必要とした。また、我々が低体格指数（BMI）のヒトドナー集団を1つ使用したこともこの結果に影響を与えた可能性がある。しかし、極端に肥満度の低いヒト集団でも、非ヒト霊長類よりも肥満度は高い[ 7 ]。
まとめると、我々のデータは、GMが成体脳のエネルギー要件と一致する方法で、異なる霊長類種の代謝を異なる方法でプログラムする原因となる役割を果たしていることを示唆している（図4）。具体的には、高EQ霊長類のGMはSCFA、特に酢酸とプロピオン酸の濃度を高め、マウスモデルではこれが食物摂取と糖新生の両方を促進し、脂肪生成を抑制するように見える。これらの宿主代謝の違いは肝臓遺伝子発現の変化と関連しており、これはGMが宿主代謝に影響を及ぼすメカニズムを示している可能性がある。しかし、主要な代謝経路を通じたエネルギーと代謝物の流れの変化など、他のメカニズムも影響力を持っている可能性が高い。栄養素の吸収が起こり、微生物叢コミュニティの構成が異なる小腸の動態を理解することで、他の興味深い経路も明らかになる可能性がある。
図4.高 EQ 霊長類と低 EQ 霊長類の代謝に対する微生物の影響に関する推定モデル。私たちの研究結果は、高 EQ 霊長類の代謝がエネルギー生成に偏り、低 EQ 霊長類の代謝がエネルギー貯蔵に偏る微生物媒介経路を示しています。
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本研究にはいくつか注意点がある。例えば、ヒトと非ヒト霊長類の糞便サンプルの採取条件の相違により、データにノイズが入った可能性がある。しかし、マウスにおける表現型効果の方向性（ヒトとリスザルのサンプルを接種したマウスは互いに類似しているが、マカクザルのサンプルを接種したマウスとは異なっていた）により、交絡バイアスの懸念は軽減される。また、各ドナー種の単一集団を使用したため、一般化が制限される可能性もあった。これまでの研究で、霊長類目全体で宿主種の影響が宿主環境/集団の影響を上回ることが実証されていることを考えると、この制約はありそうにないと考えている[ 16 ]が、ドナー種の複数の集団を組み込んだ将来の研究で、この発見をさらに検証できる可能性がある。同様に、本研究では、EQの高い霊長類2種とEQの低い霊長類1種が含まれていた。観察されたパターンを引き起こしているのは、他の宿主種特有の形質ではなく、脳関連の形質であることをさらに実証するには、追加の霊長類ドナー種を用いた実験が必要である。
この研究の結果は、脳の発達、維持、進化に関連する宿主の代謝プログラミングにおけるGMの役割についての研究を継続するための重要な基礎を提供します。より脳化された霊長類は、成体になると脳に燃料を供給するために代謝ソリューションを必要としますが、活発な脳成長を遂げている幼若動物やシナプス形成などのプロセスに関連するエネルギーコストが高い幼若動物におけるこれらの宿主-微生物ダイナミクスを調査することで、さらなる洞察が得られます[ 1、51、52 ]。今後は、さまざまな霊長類種にわたってSCFA生成パターンを体系的に比較し、SCFAが宿主の代謝を変化させる特定のメカニズムをさらにターゲットとする追加の研究が必要です。また、微生物によって生成される他の化合物が、観察されたパターンにどの程度寄与しているかについても調査する必要があります。たとえば、GMとの相互作用により腸で大量のセロトニンが生成され[ 53 ]、セロトニンは肝臓で脂肪生成を刺激し、脂肪組織で脂肪分解を抑制することができます[ 54 ]。同様に、微生物と肝臓の相互作用は、トリメチルアミンN-オキシドの生成を介して代謝表現型を媒介することが示されており[ 55 ]、これは脳の発達に役割を果たしています[ 56 ]。これらの経路の知識は、GMと宿主代謝との相互作用に関する重要なメカニズムの洞察を提供し、霊長類の脳の成長と発達を促進する近因の理解を深めるでしょう。しかし、メカニズムに関係なく、GMが宿主種間で宿主のエネルギー配分パターンを形成するのに役立つという私たちの発見は、微生物が比較的大きな脳の進化を含む、ライフヒストリーにおける種の違いの足場作りに重要な役割を果たしていることを示唆しています。
便サンプル採取ヒトの糞便サンプルについては、米国イリノイ州エバンストンから男女の成人参加者を募集しました。BMI 18.5～24.9で、過去6週間以内に抗生物質を使用したとの報告がない、年齢18～35歳の成人が、蓋付きの便器採取装置（Fisher Scientific 02-544-208）を使用して自宅でサンプルを採取しました。参加者はサンプルを涼しい場所に保管し、採取後24時間以内に当研究所に提出しました。サンプルは採取が完了するまで数日間-80℃で保管され、その後、サンプルから糞便材料1gを切り取って15mlチューブに入れ、0.1%システイン-HClを含む滅菌1×PBSでチューブを満たして処理されました。すべてのヒトサンプルは、マウス実験で使用するまで（<3か月）研究室到着後-80℃で保管されました。参加者の募集とサンプリングの手順は、ノースウェスタン大学機関審査委員会（ID: STU00206091）によって承認されたプロトコルに従いました。
マカクザルの場合、糞便サンプルは、個体が鎮静されているか、社会集団から隔離されている間に収集されました。前者の場合、個体はケタミンまたはテラゾールで麻酔され、手袋をした指を直腸に挿入してアカゲザルから少なくとも 100 g の糞便が収集されました。後者の場合、排泄された糞便サンプルは、一時的に単独で飼育されていた個体の受け皿で収集されました。正常 BMI で、過去 6 週間に抗生物質を使用していない雌雄の成体からサンプルが採取されました。サンプルは、動物 ID、収集日時、収集者のイニシャルを記載したラベルを貼った、あらかじめ重量を量ったチューブに入れられました。サンプルは下記のように処理され、実験に使用するまで (<1 か月) -80 °C で保管されました。アカゲザルの糞便サンプルは、MD アンダーソン IACUC #0000804-RN03「SPF アカゲザル繁殖研究プログラムの確立と維持」および重複する IACUC #00001437-RN02「アカゲザルにおける慢性腸炎の予備的特徴付けと大腸がんの早期検出」に基づいて収集されました。
リスザルの糞便サンプルについては、リスザルを通常の飼育施設から取り出し、十分な糞便サンプルが採取されるまで2～4時間、清潔な飼育ユニットに入れました。糞便は、清潔な検査用手袋および/または木製の舌圧子を使用して、飼育施設の床の数か所から尿で汚染されていない状態で採取しました。BMIが正常で、過去6週間に抗生物質を使用していない雌雄の成体からサンプルを採取しました。サンプルは、動物ID、採取日時、採取者のイニシャルを記入したラベルを貼った、あらかじめ重量を測定したチューブに入れました。サンプルは下記のように処理し、実験に使用するまで（1か月未満）-80°Cで保管しました。リスザルのサンプルは、MDアンダーソンIACUC #00002148-RN00、「リスザルの腸内微生物叢の特性評価」の下で収集されました。
リスザルとマカクザルのサンプルは、サンプルチューブに 0.1% システイン HCl を含む滅菌 1× PBS を入れて処理しました。サンプルは最大速度で 5 分間ボルテックスし、氷上で 5 分間静置しました。上部の液体画分 (粒子なし) はバイオーム画分として収集しました。画分のアリコートは、アマト博士の研究室に発送されるまで、-80 °C でグリセロール (最終濃度 10%) に保存しました。マウス実験で使用するまで (6～12 か月)、アマト研究室で -80 °C で保存しました。
マウスの接種とサンプル採取各種（雌雄を含む）5個体の糞便サンプルからのグリセロールストックを均質化し、プールし、滅菌PBSで希釈して経口投与溶液を作成した。16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシングにより遺伝子組み換え組成の明らかな外れ値をチェックした後、擬似ランダムにプールするサンプルを選択した。各溶液を使用して、10匹1組で飼育された離乳児の無菌C57BL/6NTacマウスに経口投与した。ノトバイオートマウスは研究期間中60日間フレキシブルフィルムアイソレーターで飼育され、処理は連続的に実行された。マウスにはオートクレーブ可能な標準飼料（総カロリーのうち、約25%のタンパク質、約17%の脂肪、約58%の炭水化物、約5%の繊維、Envigo Teklad LM-485）を与え、自由に摂取させた。マウスは、ステンレススチール製のワイヤーバー蓋が付いたポリサルフォン製の靴箱型ケージに、Alpha-dri ®の寝具と Enviro-Dri ®の巣材を敷き詰めて飼育されました。アイソレーターは、温度 72 ± 2 °F、相対湿度 30～70%、14:10 時間の明暗サイクルで維持されました。
マウスは接種後 24 時間で体重を測定してベースライン体重を確立し、糞便ペレットと 150 µl の顎下腺血液サンプルを採取しました。その後、糞便と血液サンプルを毎週採取し、マウスの体重を毎週測定しました。ドナー GM の維持を確実にするため、経口投与も毎週繰り返しました。各動物ペアの食物摂取量は、24 時間以内に与えられた食物の量と消費されなかった食物の量を測定することにより、14 日ごとに推定しました。30 日目と 60 日目に、一晩絶食させた後、各マウスに体重 1 kg あたり 2 g のグルコースを与えることにより、耐糖能テストを実施しました。血糖値は、尾を刺して、携帯型グルコース測定器 (Accu-Check) を使用して、0、15、30、60、120 分の 5 つの時点で測定しました。 60 日目に、ノースウェスタン大学の高度分子イメージングセンターで、すべてのマウスを磁気共鳴画像法 (MRI) でスキャンし、脂肪蓄積量を推定しました。その後、マウスをケタミン-キシラジンで安楽死させました。臓器を摘出し、体重計で重量を測定しました。消化管はいくつかのセクションに分けられました (胃、小腸、盲腸、大腸)。すべての消化セクションと肝臓は、安楽死後 30 分以内に -80 °C の冷凍庫で凍結されました。ノースウェスタン大学の動物管理使用プログラムは AAALAC International の認定を受けており、すべての動物実験は NU IACUC #IS00006555 によって承認されました。
MRIデータ生成各マウスは、酸素に溶解した 3% イソフルランを使用して、導入チャンバー内で麻酔されました。麻酔導入後、マウスは専用の動物用ベッドにうつ伏せにされ、呼吸数が 1 分あたり約 40 回に維持されるように、必要に応じてノーズコーンから 1～2% のイソフルランが投与されました。呼吸と体温は、枕型圧力センサーと直腸温度プローブを使用した SAI モデル 1030 MR 対応動物モニタリング システム (Small Animal Instruments Inc.、米国ニューヨーク州ストーニーブルック) でモニタリングされました。動物の体温は、動物の腹部の下に温水循環ブランケットを敷いて維持しました。水と植物油を含む参照標準を動物の背骨に沿って配置しました。
イメージングは、30 cm のボアと 12 cm の勾配インサートを備えた 9.4T Bruker Biospec 9430 (Bruker Corporation、米国マサチューセッツ州ビレリカ) で、Paravision 6.0.1 を実行して実施しました。無線周波数コイルは、送信/受信モードで動作する 40 mm 直交ボリュームコイル (Bruker) でした。マウスは、2 つの物理的視野でイメージングされました。最初は胸部がコイルの中心に位置し、次にスキャナベッドが排出され、マウスがZ軸に沿って移動して腹部がコイルの中心に位置し、スキャナベッドが磁石のボアに戻ります。視野は、頭蓋底から精巣までの解剖学的構造をカバーしました。
各物理視野について、軸方向に配向された加速スピンエコーシーケンス (T 1 Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement、T1-RARE) を使用して T 1強調画像が取得されました。使用されたパラメータは次のとおりです: TR/TE = 1000 ms/6.25 ms、RARE 係数 4、MTX = 256×256、FOV 4×4 cm、15 スライス、スライス厚 1 mm、スライスギャップ 2 mm、信号平均 2 回。各スキャンの各取得時間は約 1 分 15 秒でした。完全なスライス カバレッジを実現するために、3 つのインターリーブ スライス パッケージが取得され、それぞれが前のスライスに対して 1 mm シフトされました。各スライス ジオメトリについて、脂肪抑制スキャン 1 つと、それ以外は同一の脂肪抑制なしスキャン 1 つが取得されました。
画像はスキャナーから DICOM 形式でエクスポートされ、Amira 2019 ソフトウェア (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) にインポートされました。脂肪抑制画像と非脂肪抑制画像の両方が、水チューブからの平均信号に正規化されました。胴体と腹部のデータセットは、Amira の多平面位置合わせツールを使用して登録され、重複を減らすためにトリミングされ、マージされて、全身の脂肪抑制データセットと非脂肪抑制データセットが作成されました。全身の「脂肪マップ」は、結果として得られた 2 つのデータセットの差をとることによって作成されました。マウスの体を含む関心領域は、脂肪抑制画像から作成され、脂肪マップに重ね合わされました。脂肪ボクセルは、値が 0.25 を超えるもの (減算された画像の水チューブ値の平均 ± 2 sd ) として識別されました。脂肪率は、関心のある脂肪領域の体積と全身の体積の比として計算されました。
腸の病理最終段階では、各種の盲腸標本のサブセットが切除され、パラフィン包埋され、組織病理学的スコアリングのために処理されました。ヘマトキシリンおよびエオシン染色された組織切片は、盲検法で認定病理学者によって検査され、スコアリングされました。スコアリングパラメータには、粘膜損傷（陰窩アポトーシス、びらん、および潰瘍）、リンパ球性炎症（上皮および粘膜固有層へのリンパ球浸潤の増加、および上皮下コラーゲン層の肥厚）、および好中球浸潤（粘膜固有層、陰窩内の好中球、および浮腫性変化）が含まれていました。
16S rRNA遺伝子の配列決定と解析16S rRNA遺伝子配列決定を用いて、ドナー糞便サンプル、ドナー糞便サンプルを最初に接種してから4日後にマウスから採取した糞便サンプル、および実験の最終週にマウスから採取した糞便サンプルからGM組成を評価した。確立された実験室プロトコルを使用してDNAを抽出し、16S rRNA遺伝子のV4-V5領域を増幅した[ 57 ]。簡単に説明すると、製造元のプロトコルに若干の変更を加えたQiagen DNeasy PowerSoilキットを使用してDNAを抽出した。ドナー糞便サンプルには515 F-806R Earth Microbiome Projectプライマー、マウス糞便サンプルには515 F-926R Earth Microbiome Projectプライマーを使用して、2段階PCR増幅を実施した[ 58 ]。得られたアンプリコンをSequalPrepを使用して洗浄し、PicoGreenで定量化した。ヒト、マカクザル、リスザルのドナーサンプルはIllumina MiniSeqプラットフォームでシーケンスされ、すべてのマウスの糞便サンプルはIllumina MiSeq 2×350 bp V3プラットフォームでシーケンスされました。細菌ゲノムのコピー数は、ViiA 7リアルタイムPCRシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）[ 59 ]で16S rRNA遺伝子のリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を使用して推定されました。アンプリコンシーケンスとqPCRは、イリノイ大学シカゴ校のゲノム研究コアによって実施されました。
生のアンプリコン配列はトリミングされ、品質フィルタリングされ、ASVはQIIME2 v.2-2019.10 [ 60 ]で決定されました。分類はGreenGenesデータベース[ 61 ]を使用して割り当てられました。すべてのサンプル（ストック、最初の時点と最後の時点）のシングルエンド配列を解析し、実験サンプル（最初と最後の時点）のみのペアエンド配列を解析しました。ネガティブコントロールは、DNA抽出とPCRの両方に使用されました。ネガティブコントロールは、すべてのケースで実際のサンプルよりも配列が少ないため、それ以上の解析には含めませんでした。多様性解析の前に、すべてのサンプルのASVテーブルは10177配列に希薄化され、実験サンプルのみのASVテーブルは6573配列に希薄化され、すべてのサンプルが保持されました。 QIIME2では、重み付けなしおよび重み付けありのUniFrac距離、Faithの系統多様性、およびShannon多様性が計算され、QIIME2内のq2-breakawayライブラリが、希少でないデータからの豊富さを計算するために使用されました[ 62 ]。ドナーGMがマウスで正常に確立されたかどうかを評価するために、各ドナー種のすべてのサンプルと各時点のすべてのサンプルについて、すべてのドナー種-時点の組み合わせとコアGM機能間のペアワイズ距離が計算されました。順列分散分析（PERMANOVA）を使用して、ドナー種のアイデンティティと実験時点（ストック、最初と最後）が分類学的構成に及ぼす影響を検出し、 Rのveganパッケージ（v2.6.2）を使用して、重み付けなしおよび重み付けありの両方のUniFrac距離を検出しました[ 63 ]。負の二項分布を持つ一般化線形混合効果モデル（GLMM）を使用して、ドナー種の同一性が、希薄化されていない実験サンプルの門、科、属の相対的存在量、および最終時点のみの門、科、属の推定絶対存在量に与える影響を調べた。GLMMはglmmTMB （ v1.1.3）およびcar（v3.0.12）Rパッケージ[ 64, 65 ]を使用して実行され、科レベルおよび属レベルのモデルはfdrtool（v1.2.16）Rパッケージ[ 66 ]を使用して偽発見率について補正された。すべての分析にはRバージョン4.2.1が使用された。
メタゲノムライブラリの準備、配列決定および分析ライブラリは、最終実験時点 (上記参照) からの DNA 抽出物から、製造元のプロトコルに従い、NuGen Celero with Enzymatic Fragmentation キットを使用して構築されました。ライブラリはプールされ、PippinPrep を使用して 400～600 bp にサイズ選択され、Illumina NovaSeq SP 2×150 プラットフォームでシーケンスされました。シーケンスは、シカゴのイリノイ大学のゲノム研究コアで実行されました。
生の配列はKneadData（ http://huttenhower.sph.harvard.edu/kneaddata）を使用して品質フィルタリングおよびトリミングされました。HUMAnN2処理パイプラインは、分類および機能プロファイリングに使用されました[ 67 ]。結果として得られた遺伝子ファミリーテーブルは、KEGGオルソグループに再グループ化され、100万コピーあたりのコピー数に正規化され、層別テーブルと非層別テーブルに分割されました。パスウェイ存在量テーブルは、層別テーブルと非層別テーブルに分割されました。Bray–Curtis距離行列とJaccard距離行列は、QIIME v.2-2019.10で、層別化されていない遺伝子ファミリーとパスウェイ存在量テーブルから計算されました。 PERMANOVAは、Rのveganパッケージを使用して、Bray-Curtis距離とJaccard距離の両方で、ドナー種のアイデンティティが遺伝子ファミリーとパスウェイ構成に与える影響を検出するために使用されました。線形混合効果モデルは、ドナー種のアイデンティティが遺伝子ファミリーとパスウェイの存在量表に与える影響を調べるために使用され、lme4（v1.1-28）とcarパッケージ[ 68 ]を使用して実行されました。すべての解析にはRバージョン4.2.1が使用されました。
SCFA代謝物の抽出と分析SCFA は、最終時点でマウスから採取した糞便サンプルから抽出および誘導体化されました。すべてのサンプルについて、1 つの糞便ペレットが使用され、SCFA 分析は氷上で実施されました。サンプルは最初に正確に計量され (ほとんどのサンプルは 20～35 mg)、1 g : 5 ml の比率で 50% アセトニトリル (ACN) で均質化し、5 分間ボルテックスにかけました。次に、サンプルを 4000 g、4 °C で 10 分間遠心分離しました。SCFA 誘導体化では、サンプル上清 40 µl を 200 mM 3-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩 20 µl および 120 mM 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 – 6% ピリジン溶液 20 µl と混合し、サンプルを 40 °C で 30 分間反応させました。サンプルは、揮発によるサンプル損失を防ぐために 10% ACN で 1 ml に希釈され、イリノイ大学シカゴ校質量分析コアで液体クロマトグラフィー質量分析 (LC-MS/MS) 分析が行われるまで -80 °C で保管されました。ドナー種グループ間の酢酸、酪酸、プロピオン酸、吉草酸の濃度と相対割合の違いは、一元配置分散分析を使用してテストされました。
肝臓サンプルのRNA抽出、配列決定および分析マウス肝臓サンプルは、すべてのサンプルについて肝臓の同じ葉を組織パンチで微細解剖しました。解剖したマウス肝臓サンプルを秤量し、組織ホモジナイザー (Omni) を使用して 0.7% β-メルカプトエタノールを含む 250 µl 溶解バッファーで 15～20 秒間ホモジナイズしました。溶解物は室温で 5 分間インキュベートし、メーカーのプロトコル (Thermo Fisher Scientific、MagMax Total RNA 分離キット、A27828) に従って追加の DNase ステップを追加して KingFisher Flex (5400630 l Thermo Fisher Scientific) で RNA 抽出を行いました。RNA の品質は、RNA 6000 Nano Assay with BioAnalyzer (Agilent) を使用して測定し、RNA 濃度は Quant-it RNA High Sensitivity アッセイ キット (Thermo Fisher Scientific、Q33140) を使用して測定しました。 RNAサンプルは100 ng µl −1に正規化され、シーケンスに提出する前に-80 °Cで保存されました。
抽出されたRNAサンプルは、タグベースRNAシーケンシングのためにテキサス大学オースティン校のゲノム配列解析施設に送られました。この方法は、ポリアデニル化転写産物の存在量を測定するために特別に設計された費用対効果の高いアプローチであり、十分に注釈が付けられたゲノムにおける差次的遺伝子発現解析のための信頼性の高いデータを生成します[ 69 ]。ライブラリは、Meyer et al . [ 70 ]およびLohman et al . [ 69 ]から修正されたプロトコルを使用して構築されました（更新バージョンはMatz lab Githubで入手可能：https ://github.com/z0on/tag-based_RNAseq/blob/master/TagSeq_sample_prep_june2019.docx ）。リードはNovaSeq 6000 SR100でシーケンスされ、最小リード数は400万、ターゲットリード数はサンプルあたり500万でした。
生のリードは、Meyer et al . [ 70 ] およびLohman et al . [ 69 ] （UT AustinのMatz研究室が管理; https://github.com/z0on/tag-based_RNAseq/blob/master/tagSeq_processing_README.txt）に基づいて提供されたTagSeqデータ処理パイプラインに従って処理され、遺伝子数データが得られました。簡単に説明すると、FASTX-Toolkit（http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit）とCUTADAPT v. 2.8 [ 71 ]を利用したカスタマイズされたPerlスクリプトを使用して、’ A ‘ ≥ 8塩基のホモポリマーランを含むリードが除去され、最低20塩基のリードが保持され、PCR重複が除去されました。次に、処理されたリードは、Bowtie2 [ 72 ]を使用してMus musculusリファレンスゲノム（Ensemblリリース99）にマッピングされました。
差次的遺伝子発現解析はDESeq2 in R v 3.6.2 [ 73 ]を用いて実施した。偽陽性率は5%に抑えられた [ 74 ]。調整P値0.05およびlog2倍変化>1.5を差次的発現遺伝子のカットオフとして使用した。
MiMeNet解析では、生の16S rRNAカウントを中心対数比変換を使用して変換し、種間の比較全体で差次的に発現した遺伝子の和集合をDESeq2の分散安定化変換を使用して変換しました。次に、変換されたマイクロバイオームと変換された遺伝子発現を入力として使用してMiMeNetを実行し、微生物と遺伝子の機能モジュールを取得しました（https://github.com/YDaiLab/MiMeNet ）。遺伝子セットエンリッチメント解析は、RITANパッケージとReactomeパスウェイ[ 75 ]を使用して、MiMeNetによって識別された各遺伝子モジュールに対して実行されました。MiMeNetはPython 3.7を使用して実行され、遺伝子セットエンリッチメントはRバージョン4.2.1を使用して実行されました。
機能遺伝子解析では、生の遺伝子数をフィルタリングして、すべてのサンプルで 10 未満の遺伝子を除外しました。次に、DESeq2 を使用して 3 種をペアで比較し、調整されたP値しきい値 0.05 を使用して、差異遺伝子を特定しました。RITAN パッケージと Reactome パスウェイを使用して、各比較内のフォールド変化値が 2 より大きいか -2 未満の差異遺伝子に対して遺伝子セット エンリッチメント解析を実行しました。すべての解析とプロットは、R バージョン 4.2.1 を使用して生成されました。
生理学的測定と分析アルカリホスファターゼ（ALP）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、トリグリセリド、コレステロール、高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質および脂肪血症の血中濃度は、Idexx の標準アッセイを使用して評価されました。肝臓グリコーゲン濃度を定量化するために、肝臓組織サンプルは、2 mm 生検パンチ（WP2020F、World Precision Instruments、フロリダ州サラソタ）を使用してクライオスタットで解剖され、1 mm ジルコニア/シリコンビーズ（11 079 110z、BioSpec）を含む 2 ml 強化マイクロバイアル（2007、BioSpec Products、Inc.、オクラホマ州バートレスビル）に充填されました。解剖した組織サンプルを秤量し（平均重量（SD）= 16.8（3.5））、ビーズビーター（607、BioSpec）を使用して1 mlのアッセイバッファーでホモジェナイズしました。サンプルはヒートブロック上で100 °Cで10分間煮沸して酵素活性を不活性化し、その後18,000 rpmで4 °Cで10分間遠心分離しました。上清をアッセイバッファーで40倍に希釈しました。希釈したホモジェネートは、グリコーゲンアッセイキットのマニュアル（700 480、Cayman Chemical Company、ミシガン州アナーバー）の説明に従って処理しました。ドナー種に対する各生理学的測定値の差異は、分布に応じて生データまたは変換されたデータのいずれかで一元配置分散分析を使用して評価しました。
CIFAR の「人間とマイクロバイオーム」フェローシップ (KRA)。Samsung Scholarship Foundation (WL)。
著者は Anthony Pulvino 氏と Yan Zeng 氏に感謝の意を表します。
概念化: KRA 方法論: KRA、EKM、BL、RS、G-.YY、YD、JPC、CRH、ERL 調査: KRA、EKM、SK、WL、DR、HJ、SC、EAW、LDM、G-.YY、MLSS、SG、LEW、CRH、ERL 可視化: KRA、EKM、DR、HJ、EAW、G-.YY、CRH、CWK 資金調達: KRA、RS、JPC、CRH、ERL プロジェクト管理: KRA 監督: KRA、EKM、SK、RS、MLSS、SG、LEW、YD、JPC、CRH、ERL 執筆 – 原案: KRA、EKM 執筆 – レビューと編集: KRA、EKM、SK、WL、DR、HJ、SC、EAW、BL、RS、LDM、G-.YY、MLSS、SG、 LEW、YD、JPC、CRH、ERL、CWK、KRA
ヒト被験者の研究プロトコルは、ノースウェスタン大学機関審査委員会 (IRB プロトコル # STU00206091) によって承認されました。アカゲザルの糞便サンプルは、MD アンダーソン IACUC # 0000804-RN03「SPF アカゲザル繁殖研究プログラムの確立と維持」および重複する IACUC # 00001437-RN02「アカゲザルにおける慢性腸炎の予備的特徴付けと大腸がんの早期発見」の下で収集されました。リスザルのサンプルは、MD アンダーソン IACUC #00002148-RN00「リスザルの腸内微生物叢の特徴付け」の下で収集されました。マウスの研究はすべて、ノースウェスタン大学 IACUC (#IS00006555) によって承認されました。
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